タンパク質に関する実験

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資料紹介

生物化学実験レポート
タンパク質に関する実験
１．寒天ゲル電気泳動
pH8.6、4.3での泳動と染色・脱染色
11月20日：pH8.6での泳動と染色・脱染色
【目的】タンパク質の電気泳動では、両性電解質溶液を電気泳動すると陽極側が酸性、陰極側がアルカリ性になり、ここにタンパク質を加えると各タンパク質が等電点の順に並ぶ。荷電粒子や分子はその荷電と反対の極に向かって移動する。移動中に pH 勾配があると、荷電が0となる点（等電点）で停止する。これが等電点電気泳動である。(電気泳動法は、DNAやRNAなど核酸を分離するのにも広く用いられており、分子生物学の基本技術のひとつといえる。)この等電点の違いにより物質を分離する等電点電気泳動(IEF)を、セルロースアセテート膜を担体として用いてTris　Gly　HCl　緩衝液pH8.6で試料タンパク質を分離する。アミドブラック－10Bの7％酢酸溶液でタンパク質を固定・染色し、7％酢酸で背景を脱染色してタンパク質の易動度を観察する。
【試薬と器具】〔試料〕Albumin(bovine　serum)[分子量66.000、等電点4.7~4.9]、Hemoglobin(human　blood)[分子量64.550、等電点6.8~7.0]、Lysozyme(egg　white)[分子量14.300、等電点11.0~11.4]
以上のたんぱく質を0.6％NaCL溶液(0.02％NaN3を含む)に4mg/ml(0.4％)になるように溶解した溶液を使用する。
〔担体〕セルロースアセテート膜：1枚
〔pH8.6緩衝液〕Tris:30.29g　Gly:7.51g　HCl:1N42g　DW:1L　buffer〔マーカー〕Bromphenol　blue（BPB）0.1％水溶液、Metyl　green(MG) 　0.1％水溶液
〔染色液〕Amido　Schwartz　10B　0.2％脱染色液溶液
〔脱染色液〕7％酢酸水溶液
DW、泳動槽、ろ紙、ピンセット、ガラス板
【方法】１）セルロースアセテート膜を槽にセットし(ろ紙で足りない部分はブリッジ)、短冊状に切ったろ紙を緩衝液に浸した後、ガラス板上のセルロースアセテート膜と電極槽を接続した。
　　　　　　　　２）約1×10mlのNO.2ろ紙を試料に浸し、キムワイプで過剰の試料を取り除き、セルロースアセテート膜の極側に長辺が平行になるよう密着させて置いた。また試料を置いた場所をマークするため、墨汁とろ紙片と並べてスポットした。
３）マーカーのBPB溶液とMG溶液は、2×2mmのNO.2ろ紙を用いて試料と同位置に試料と重ならないようにセルロースアセテート膜上にスポットした。
　　　　　４）150V・30分間、泳動槽で泳動させた。
　　　　　５）泳動終了後、セルロースアセテート膜を染色槽に入れ、約2分間染色した。
　　　　　６)メンブレンを傷つけないように染色液から脱染色液(7％酢酸水溶液)に移し、槽を穏やかにゆすった。また液は３回交換した。
　　　　　７)アセテートセルロース膜を、ガラス板に載せ乾燥させた。
【結果】
pH8.6
150V・30分間　　泳動槽で泳動させたら、Hemoglobinは＋側に1.2㎝、Lysozymは
－側に3.3㎝、BSAは＋側に2.2㎝動いた。
表１
タンパク質等電点等電点－緩衝液のpH 移動方向移動距離(cm) Hemoglobin 6.8～7.0 －1.6～－1.8 ＋ 1.2 Lysozym 11.0～11.4 2.4～2.8 － 3.3 BS