遺伝子組み換えタバコからのタンパク質の抽出、タンパク質定量とSDS-PAGE

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資料紹介

遺伝子組み換えタバコからのタンパク質の抽出、
タンパク質定量とSDS-PAGE
実験日 6月29日、30日
目的遺伝子組み換えタバコからタンパク質を抽出し、吸光度測定によってタンパク質を定量する。次にタンパク質をSDS-PAGEによって電気泳動する。
原理
タンパク質の抽出：タバコの葉からタンパク質を抽出する場合、まず、界面活性剤であるSDSをを含まない緩衝液で抽出し、可溶性タンパク質画分を得る。続いて、抽出残蹉渣を含む緩衝液で抽出し、膜タンパク質を可溶化する。
タンパク質の定量(ブラッドフォード方)：色素Coomassie brilliant blue G250の賛成溶液の最大級光度が、色素がタンパク質に結合すると465nmから595nmに移動することを原理としている。色素は主に塩基性と芳香族のアミン酸残基に結合する。結合する色素の量はタンパク質の量に比例するので、色素の595nmの吸収を測定することによってタンパク質質量を求めることができる。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE) : タンパク質を2-メルカプトエタノール処理をしてS-S結合を切断、ポリペプチド鎖に解離し、さらにSDS（ラウリル硫酸ナトリウム）で変性後、電気泳動し、分子量によって分離する。
実験材料
実験1
抽出緩衝液Ⅰ(125mMTris-HCl / pH6.8) 1ml
抽出緩衝液Ⅱ(125mMTris-HCl / pH6.8 , 4%SDS) 1ml
実験2
BSA標準溶液 (10 ) 10ml
蒸留水
Dye reagent 3ml
実験3
分離ゲルバッファー (1.5 M Tris-HCL/pH8.8 , 0.4% SDS)
30%アクリルアミドストック溶液（29.9％アクリルアミド , 0.8% N,N’-メチレンビスアクリルアミド）
1.5％過硫酸アンモニウム
TEMED (N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン)
濃縮ゲルバッファー (0.5M Tris-HCl / pH6.8 , 0.4%SDS)
10X 泳動バッファー組成 (250 mM Tris-HCl / pH8.8 , 1.92 M グリシン , 1%SDS)
2X サンプルバッファー (20% Glycerol , 4%SDS , 125mM Tris-HCl / pH6.8 , 12% メルカプロエタノール , 0.004％BPB)
固定液 (メタノール 100ml , 酢酸 20ml , 脱イオン水 80ml)
染色液 (染色液 A 30ml , 染色液B 30ml)
タンパク質分子量マーカー
Phosphorylase B 113,000
Bovine serum albumin 92,000
Obalbumin 52,300
Carbonic anhydrace 35,300
Soybean trypsin inhibitor 28,700
Lysizyme 21,300
実験方法
実験1 タバコ葉からの蛋白質の抽出
野生型タバコおよび遺伝子組み換えタバコの葉から、2cm四方ぐらいの切片を切り出し、エッペンチューブに入れた。
200μlの抽出緩衝液を入れ、ぺっセルで完全にすりつぶした。
遠心 (15000rpm, 5min) し、上澄み液を新しいエッペンチューブに移した。抽出緩衝液Ⅰには界面活性剤が入っていないので可溶性タンパク質のみが抽出された。これが可溶性タンパク質画分となる。
沈殿に200μlの抽出緩衝液Ⅱを加え、ペッセルで葉を完全にすりつぶし、遠心